CRISPR-客製化抗體-盟基生物科技股份有限公司

CRISPR

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最新基因編輯工具 CRISPR,超高專一性針對基因,可做基因剔除、插入或是活化。

產品介紹

CRISPR 為劃時代的基因編輯工具,Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein (Cas) 為細菌特殊專有的免疫系統,以 RNA 為探針,專一性地辨認進入細菌內的外源的病毒核酸,並透過 Cas 核酸剪切酶 (endonuclease) 特性分解病毒的核酸,保護細菌免受病毒感染。如此特殊的核酸裁切系統被科學家們應用於基因編輯,相較於傳統的 Cre recombinase、Zinc finger nucleases、Transcription activator-like effector nucleases (TALENs),CRISPR 系統專一性更高和操作更簡單。CRISPR 中的 RNA 探針是以鹼基配對的方式辨認到目標基因,因此專一性更高,RNA 探針也較容易設計,價錢也更便宜。
RNA 探針本來為兩段 RNA:CRISPR RNA (crRNA) 和 trans-activating crRNA (tracrRNA),後來科學家們發現將兩段合而為一 guide RNA (gRNA),更穩定效果也更好,Genscript 皆有提供 gRNA 和 crRNA/tracrRNA 合成服務。Cas9 蛋白質透過 gRNA 和目標基因的互補性,專一性結合目標基因染色體 DNA,並進行雙股裁切 (double strand break, DSB)。細胞中發生 DSB 的染色體會以兩種方式修復 (圖一),NHEJ 會造成基因功能缺失 (knock out),HDR 加上引入 ssDNA template 則可以插入或置換特定序列 (knock-in)。


圖一:CRISPR 作用示意圖。Cas9 蛋白質透過 gRNA 和目標基因的互補性,專一性結合染色體 DNA,並造成 DNA 雙股斷裂 (double strand break, DSB)。細胞中的 DSB 會以兩種方式修復,左下角的 NHEJ (non-homologous end-joining) 方式為透過隨機剔除或插入一些鹼基,將斷裂的兩端黏在一起。如果剛好斷裂點發生在基因中間,如此便會導致基因失去功能,造成蛋白質 knock out。右下角則是 HDR (homology directed repair),透過另外一條染色體的配對和重組蛋白的幫助,完整修復 DNA。這種方式不會造成鹼基剔除或插入,而且如果同時送入細胞 ssDNA template,還可以插入或置換特定的序列,形成 knock-in。

Genscript 提供的 CRISPR 項目可分成產品和客製化服務,產品有 CRISPR gRNA plasmid、CRISPR Library、Cas9 enzymes、Gene editing kits、Cas9 antibodies,客製化服務則是包含 gRNA synthesis、ssDNA、CRISPR KO stable cell line、Microbial Gene Editing,而 CRISPR gRNA plasmid 和 CRISPR Library 也可依據特殊需求客製化製作。Genscript 和張鋒實驗室共同合作 (Feng Zhang's laboratory at the Broad Institute of MIT and Harvard),免費提供 gRNA 資料庫和設計軟體,另外也有提供多種載體,包括不同的 Cas9 蛋白系統、選擇 all-in-one 或是 dual vector、轉染用質體或是慢病毒載體。Genscript 提供的 Cas9 蛋白系統有五類:SpCas9、eSpCas9、SpCas9 Nickase、SaCas9 和 Transcription Activation (SAM) Vectors,以下分別簡單介紹 (表一) (完整載體資訊請點我連結)


表一:Genscript 提供五種 CRISPR 系統。(完整載體資訊請點我連結)
 

1. SpCas9 vectors:
SpCas9 為最早應用於基因編輯的 CRISPR 系統,來自於 S. pyogenes 的 type II CRISPR systems。


2. eSpCas9 vectors:
eSpCas9 為 SpCas9 經過三個點突變 (K848A, K1003A, R1060A),可以減少 non-target DNA 的結合,大幅提高專一性。CRISPR 系統作用時,除了需要 gRNA 以互補的方式辨認並打開染色體 DNA,還需要 Cas9 蛋白質的活性幫助打開雙股 DNA,eSpCas9 突變的三個位點即為打開 DNA 的活性位點。而實際上 CRISPR 系統作用時,不需要 gRNA 和 DNA 序列完全互補,在 Cas9 的幫忙下可以忍受數個鹼基的不同,因此常會發生 off-target。透過突變這三個位點,使得 Cas9 作用減小,因此 gRNA 必須要完全互補 DNA,才能夠打開雙股 DNA,因此可以大幅度減少 off-target,增加專一性。


3. SpCas9 Nickase Vectors:
SpCas9 nickase 為 SpCas9 經過一個點突變 (D10A),此位點突變會削弱 Cas9 雙股核酸剪切的特性,只能進行單股核酸裁切 (single strand break, SSB),稱為 Cas9 nickase (Cas9n)。細胞中 SSB 的修復較為容易,不會造成基因缺失。因此,SpCas9 使用上必須同時引入兩段 gRNA,辨認鄰近的區域 (需要是 DNA 雙股各一股),造成兩個鄰近的單股 DNA 斷裂 (圖二)。由於只有發生一個 SSB 的 DNA 會完好無損地修復,只有同時有兩個 SSB 才會引發 NHEJ,造成基因缺失,因此 SpCas9 nickase 可以大幅度降低 off-target,增加專一性。

 
圖二:SpCas9 nickase (Cas9n) 作用示意圖。需要同時有兩段 sgRNA 作用在鄰近的區域,才能有效地造成 DNA 缺失。


4. SaCas9 Vectors:
Adeno-associated virus (AAV) 病毒系統有別於慢病毒系統 (Lentivirus),AAV 感染細胞後並不會將 DNA 嵌入細胞的染色體,因此可以被應用於臨床治療上。但是,AAV 最大的限制在於能夠包裝的 DNA 較短 (∼4.85 kb including both ITRs),而 SpCas9 約為4.3 kb,加上其他必要元件就會超過 AAV 的限制。而 SaCas9 來自於 Staphylococcus aureus,作用效率和 SpCas9 差不多,但是 SaCas9 蛋白質較小 (少1 kb DNA 序列),因此非常適合用作 AAV 包裝。


5. Transcription Activation (SAM) Vectors:
SAM 為特殊的 CRISPR 系統,其中 Cas9 透過突變而失去核酸裁切的功能 (dCas9),同時又接上 transactivation protein (VP64),sgRNA 也經過特別設計 (加上 two MS2 RNA aptamers),同時表現 MS2-P65-HSF1 activation helper protein,此促進基因活化蛋白透過辨認 MS2 aptamer,和 VP64 一起專一性地促進基因表現。

 
圖三:SAM CRISPR 示意圖,Cas9 蛋白質失去核酸裁切活性 (dCas9),同時加上 VP64,sgRNA 加上 MS2 RNA aptamer,另外再表現 MS2-p65-HSF1。透過 dCas9/sgRNA 專一性辨認目標基因,MS2-p65-HSF1 專一性結合 MS2 RNA aptamer,p65/HSF1 和 VP64 一起促進基因表現。



CRISPR gRNA plasmid:
Genscript 免費提供 gRNA 資料庫,可自行搜尋想要的基因,每個基因都有數條 gRNA 可供選擇 (搜尋網址請點我連結),也可以參考資料庫列表 (請點我連結)。資料庫中 gRNA 少部分有足夠庫存,可以馬上出貨,一週內到貨。除了可以選擇其他載體,還可以免費由 Genscript 設計或自行提供 gRNA 序列。最終提供 4 ug 質體和定序比對結果。


■ CRISPR Library:大規模篩選基因工具
使用最新晶片電化學方式合成 oligo library,具有高度一致性和正確性,並建構到慢病毒載體上,建構出 CRISPR library (圖四)。分三種已設計好的 library,可直接訂購,省下設計時間和人力 (詳細針對基因資訊請點我連結)
 

圖四:CRISPR library 使用方法,拿取已經建構完成的 CRISPR library,並製作慢病毒 library,感染細胞並經過篩選後,找出 phenotype 改變的細胞株,進而發現相關的基因。


1.GeCKO library for genome-scale knock-out (詳細針對基因資訊請點我連結)
針對人類或小鼠的所有基因,每個基因設計三條 gRNA,並含有 1,000 non-targeting control gRNA。Library A 還有針對 miRNA,針對的基因更全面 (表二)。載體有兩種選擇,pLentiCRISPR v2 和 pLentiGuide-Puro/pLentiCas9-Blast,並可選擇25 ug/100 ug/200 ug 包裝 (請見訂購資訊)。


表二:GeCKO library for genome-scale knock-out 詳細資訊 (詳細針對基因資訊請點我連結)
 

2. Pathway-specific library:
針對細胞中某功能路徑,如 apoptosis, cell cycle 等,也有針對某疾病,如 adipogenesis, bladder cancer 等。


表三:Pathway-specific library 詳細資訊 (詳細針對基因資訊請點我連結)
 

3. Transcriptional activation library:
可促進基因表現。針對人類或小鼠的所有基因,每個基因設計三條 gRNA (詳細針對基因資訊請點我連結)。一樣可選擇25 ug/100 ug/200 ug 包裝,並贈送 pLenti dCas-VP64_Blast 和 pLenti MS2-P-HSF1_Hygro (此為必須和 gRNA plasmid 一起送進細胞的質體) (請見訂購資訊)。



■  Cas9 enzymes:
除了以質體 DNA 方式送入基因,讓細胞表現gRNA 和 Cas9 protein,也可以使用 DNA-free 系統,直接送入 gRNA 和 Cas9 protein,形成 ribonucleoprotein (RNP) 作用。DNA-free 好處在於沒有外源的 DNA,因此不會造成 DNA 隨機嵌入染色體,引發不可預期的突變。
Genscript 提供優質確效的 Cas9 nuclease protein,並接上 NLS (nucleus localization sequence),確保 Cas9 蛋白質會進入細胞核 (表四)。另外,Genscript 也有提供 T7 Endonuclease I,用來檢驗 CRISPR 是否成功 (圖五)。如果成功發生 DSB,則目標基因的序列會和 wild type 不同,兩者雜合時則無法完全互補配對,T7E1 nuclease 會辨認無法配對的單股區域,並進行 DSB,造成電泳時多出額外的小片段。


表四:Genscript 的 Cas9 nuclease 種類。

 

圖五:T7E1 檢測 CRISPR 成功與否範例圖,如果成功發生 DSB,則目標基因的序列會和 wild type 不同,兩者雜合時則無法完全互補配對,T7E1 nuclease 會辨認無法配對的單股區域,並進行 DSB,造成電泳時多出額外的小片段。



 Gene editing kits (請見表五):


表五:Gene editing kits 產品內容和功能列表。
 

1.GenCrispr Mutation Detection Kit
用來檢測 CRISPR 是否成功,包含 High-Fidelity DNA polymerase 和 GenCrispr T7 Endonuclease I。目標細胞 wild type 和 CRISPR 實驗後的染色體 DNA 先進行 PCR 放大目標基因片段,兩者的純化產物進行雜合後,以 T7 Endonuclease 反應,並以電泳分析,成功者則會多出小片段 (圖五)。


2.sgRNA Screening Kit
用來體外快速篩選 gRNA,包含 Cas9 Nuclease 和其反應溶液。先以 PCR 放大目標基因片段,加入不同的 gRNA,以 Cas9 nuclease 反應,再以電泳確認小片段的產生 (圖六)。

 
圖六:目標基因加入11條不同的 gRNA,以 Cas9 nuclease 反應 1 h at 37°C,結果只有 gRNA9 有成功產生小片段。


3.High-Efficiency gRNA-Cas9 Plasmid Assembly Kit
提供 Cas9 Vector,自行建構 gRNA-Cas9 質體 (圖七)。分成環形或線形的載體,以及可以選擇 puro 或是 GFP。gRNA 插入的位點有設計 suicide reporter gene,方便轉形後篩選。另外還有附 control gRNA 和定序用 primer。
 

圖七:建構 gRNA-Cas9-GFP 質體示意圖,gRNA insert site 有 suicide reporter gene,方便篩選。


4.GenCrispr sgRNA Synthesis Kit
自行合成 gRNA 的 DNA template,並做體外轉錄 gRNA。gRNA 的 DNA template 包含 T7 promoter、Target sequences 和 crRNA/tracrRNA constant region,以 PCR 方式組合上述元件 (圖八)。完成後可以接到載體上作保存,並作體外轉錄 gRNA。此套組不只適用於自己組合 gRNA 表現載體,透過體外轉錄自行製作 gRNA 的部分可應用於大量篩選。

 
圖八:組合 T7 promoter、crRNA 和 tracrRNA 示意圖,同時加入圖中四條引子和 Tracr fragment,以 PCR 方式作組合,其中 Target F1/R1 由客戶自行設計。


 Cas9 antibodies:
用來確認細胞是否有表現 Cas9 蛋白質。以慢病毒或 nanoparticle 送入基因後,為了確認細胞有表現 Cas9 蛋白質,需要以抗體確認,可以使用 Western Blotting、FACS、ELISA、IHC。


 

產品特色


CRISPR gRNA plasmid:

1.免費提供 gRNA 資料庫和專業設計軟體:
經由和張鋒實驗室共同合作,針對每個基因設計出三條以上的 gRNA,也可提供序列客製化設計。每個基因都有數條 gRNA 可供選擇 (搜尋網址請點我連結),也可以參考資料庫列表 (請點我連結)

2. 多種 Cas9 系統選擇:
SpCas9, eSPCas9, SpCas9 nickase, SaCas9 (knock-out), SAM (促進表現),前四類用來剔除基因,SAM 則是用來促進特定基因的表現。

3. 多種載體可選擇:
轉染用、慢病毒系統 (all-in-one 或 dual vector)、AAV 系統。
All-in-one 好處在於 gRNA 和 Cas9 可以一起表現,而 dual vector 則是常用來製作 library,先在細胞中穩定表現 Cas9,再以 gRNA library 製作的慢病毒 library 感染細胞,製作出 knock-out library。
使用轉染用質體好處在於操作比較簡單,而慢病毒系統雖然製作比較麻煩,但是好處在於可以於細胞中穩定 Cas9/gRNA。AAV 免疫性較低,適合拿來做 in-vivo 的基因遞送。

4. 現貨最快一週到貨


CRISPR Library:大規模篩選基因工具

1. 最新晶片電化學方式合成,每條 gRNA 具有高度一致性
2. Knock out 和 SAM 選擇
3. 可一次針對所有基因或是針對特定疾病

 

訂購資訊


CRISPR gRNA plasmid:
每個基因都有數條 gRNA 可供選擇 (搜尋網址請點我連結),也可以參考資料庫列表 (請點我連結)

CRISPR Library:大規模篩選基因工具
 


*100 µg and 200 µg library are delivered as 4 x 25 µg or 8 x 25 µg.

Cas9 enzymes:
 


Gene editing kits:
 


Cas9 antibodies:
 

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