DNA突變圖庫(Mutant library)-Gene Services-盟基生物科技股份有限公司

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DNA突變圖庫(Mutant library)

DNA突變圖庫(Mutant library)

Gene Service

DNA突變圖庫(Mutant library)

DNA突變圖庫 (Precision mutant library) 服務是以新一代半導體晶片合成 DNA oligo,搭配特殊圖庫建構技術,完成 DNA 突變圖庫建構。可以指定胺基酸密碼子、每個突變位點的胺基酸數目、每個胺基酸的比例,比起傳統 Degenerate NNK 方式,均勻度和正確性更高。

蛋白質的功能由胺基酸序列決定,而胺基酸序列由 DNA 決定。除了以突變劑作「隨機的突變」,或是針對特定位點做「點突變」之外,還可以藉由文獻和經驗找出重要功能的片段,針對「指定的片段進行隨機的突變」。傳統上會使用 Degenerate NNK oligo,建構 DNA 突變圖庫,雖然價格便宜且操作方便,但是常常會有 library 缺失的情形發生,某些重要的胺基酸缺失導致分析結果失真。GenScript 提供全新的服務,可以完美建構 DNA 突變圖庫。

一、服務介紹
GenScript 和 CustomArray 合作開發半導體晶片,能夠一次大量合成 DNA oligo,每個晶片位點單獨合成一條 DNA oligo (圖一)。每個位點以電壓精準控制和監測 DNA 的合成,確保每一條 DNA 序列正確。相比於 Degenerate NNK 是一個管柱同時混和所有可能的 DNA,GenScript 半導體晶片是單獨合成每一條需要的 DNA,因此能夠精準地控制所有 DNA 的序列和比例。

圖一:以半導體晶片合成 DNA 示意圖,每個晶片位點單獨合成一條 DNA oligo。

以半導體晶片合成完 DNA oligo 後,再搭配原廠優化後的建構技術,完成 DNA 突變圖庫 (圖二)。客戶可以選擇每個位點的胺基酸數目、每個胺基酸對應的密碼子,還能夠指定每個胺基酸的比例,彈性非常高沒有任何限制。(GenScript 亦提供 DNA 組合圖庫,請點選此連結)


圖二:以半導體晶片合成完 DNA oligo 後,接續建構突變圖庫,突變方式有三種,只針對單一位點 (site-saturation);或是一次針對連續位點的一個位點 (saturation scanning);以及同時針對所有種突變組合 (Combinatorial)。



二、服務應用
1. 針對抗體 CDR 序列,增加專一性和親和力。
2. 增加酵素親和力和穩定性。
3. 研究特定胺基酸位點對蛋白質結構和功能的影響。




三、服務優點
1. 精準控制胺基酸的分布和比例,完勝傳統 Degenerate NNK 和 Trimer library 方法。
傳統 Degenerate NNK 方式由於 codon table 的關係,每個胺基酸有不同數量的密碼子 (codon bias),因此每個胺基酸的比例會不同,而且只能20個胺基酸全部都有,中間還會出現終止密碼子,讓蛋白質斷開失去功能。
而 Trimer library 雖然可以達成胺基酸分布均勻,但是沒辦法指定特殊比例,而且只能20個胺基酸全部都有。GenScript 半導體晶片合成的 DNA oligo 不但可以選擇特定的胺基酸,還能夠指定胺基酸比例,並且比例非常均勻。
 

圖三:Degenerate NNK 和 Precision mutant library 比較,Degenerate NNK 胺基酸分布不均勻,而且只能20個胺基酸都有。而 Precision mutant library 可以指定特定胺基酸 (AA1 位點只有三個胺基酸),而且胺基酸分布非常均勻。

2. 可針對物種指定胺基酸密碼子。
傳統 Degenerate NNK 方式是用一個管柱同時混和所有可能的 DNA,因此所有的 DNA 序列都有,無法指定胺基酸密碼子。而 Trimer library 因為本身 trimer 合成困難,因此市面上僅有少種的 trimer 組合,如果要客製化合成 trimer,價格會非常高。相反地,GenScript 半導體晶片合成的 DNA oligo 是在每一個晶片位點上單獨合成一條 DNA oligo,因此可以指定胺基酸密碼子。

3. 降低圖庫數目,可減少篩選時間和成本。
傳統 Degenerate NNK 方式最大的優點在於便宜,但是由於是所有組合,所以圖庫非常大,以4個位點20個胺基酸來說,圖庫大小為 4^12=16,777,216,如此龐大的圖庫很難有效地篩選。而且因為 codon bias 的關係,某些胺基酸比例較少,很有可能於篩選過程中消失,最後得到的序列可能不是最好的結果。這些因素都會增加篩選時間和成本,也會增加研究的成本。相反地,Precision mutant library 圖庫大小為20^4=160,000,只有 Degenerate NNK 的1/100,雖然前期建構成本較高,但是可以減少後期的篩選成本,而且由於胺基酸比例均勻,比較能夠篩選到最好和有效的結果。

4.覆蓋率接近100% (by NGS)
由於 Degenerate NNK 方式圖庫過於龐大,而且因為 codon bias 的關係,某些胺基酸對應的密碼子較少,因此於建構時容易失去一些胺基酸序列,導致覆蓋率只會有60-80%。相反地,GenScript 半導體晶片合成的 DNA oligo 胺基酸比例均勻,建構圖庫時比較不容易遺失。同時搭配 GenScript 獨家優化後的圖庫建構試劑和技術,可以保證每個位點覆蓋率90%以上。依據原廠過去經驗,基本上都可以達到100%覆蓋率。

5. 專業技術直接完成質體圖庫建構,附上完整 QC,省下建構時間。(只要4-6週)
如果是以傳統 Degenerate 方式建構圖庫,只能跟廠商訂購 DNA oligo,由客戶自行建構圖庫,還要花時間確認覆蓋率。GenScript 可以直接幫客戶完成 DNA 突變圖庫建構,附上完整 NGS 檢測 QC 報告,省下時間和人力,交期又快只要4-6週。



四、服務方案
提供 PCR product (PCR product library),由客戶自行完成質體建構;或由原廠直接完成質體建構 (Cloned library (Plasmid)),省下大量時間和人力。方案如下:

表一:兩種方案比較
方案 Cloned library (Plasmid) PCR product library
客戶提供 (1) 欲突變的 DNA 序列 (可提供含基因的質體 or 全基因合成)
(2) 突變方式 (包含突變位點 & 胺基酸分布和比例)
(3) 4 ug 載體 & 載體完整資訊
(1) 欲突變的 DNA 序列 (可提供含基因的質體 or 全基因合成)
(2) 突變方式 (包含突變位點 & 胺基酸分布和比例)
出貨規格 (1) 4 ug 凍乾質體 & 1 mL 甘油菌
(2) NGS QC 報告
(1) 500 ng dsDNA PCR product
(2) NGS QC 報告
圖庫大小 保證 1x10^6-7 variants (僅適用 High copy 質體) 保證 1x10^8-10 variants
正確率 保證每個胺基酸位點誤差比例 25% 以內 保證每個胺基酸位點誤差比例 25% 以內
覆蓋率 由 NGS 檢測,保證每個突變位點覆蓋率 90% 以上 由 NGS 檢測,保證每個突變位點覆蓋率 90% 以上