Plasmid (質體建構)-CRISPR Services (基因編輯服務)-盟基生物科技股份有限公司

CRISPR 被稱為第三代基因編輯技術，相較於先前的 TALEN 與 ZFN 系統而言，CRISPR 操作更簡單，且成功率更高。Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein (Cas) 為細菌特殊的免疫系統，保護細菌免受病毒感染。CRISPR 技術是由 Cas9 蛋白質透過 gRNA 和目標基因的鹼基配對互補性，專一性結合目標基因染色體 DNA，並進行雙股裁切 (double strand break, DSB)。而發生 DSB 的染色體會以兩種方式修復，NHEJ (non-homologous end joining) 容易造成基因功能缺失 (knockout)，而 HDR (homology-directed repair) 引入 ssDNA template 則可以插入或置換特定序列 (knockin)。鹼基配對的特性使得 CRISPR 專一性更高，操作和設計更簡單，因此被廣泛應用於基因工程領域。GenScript 提供 CRISPR plasmid 質體建構服務，讓您快速拿到 CRIPSR 工具。

一、服務介紹

GenScript 和張鋒實驗室共同合作 (Feng Zhang’s laboratory at the Broad Institute of MIT and Harvard)，免費提供 gRNA 資料庫，並且超過20,000 條 gRNA 已建構成庫存質體 (載體為 pLentiCRISPR v2，SpCas9 系統、慢病毒表現系統)，可以直接購買快速到貨。同時，客戶也能提供自行設計或文獻中的 gRNA 序列，並選擇不同的載體，由 GenScript 完成質體建構。載體類型除了送入細胞方式的不同 (慢病毒、轉染或 AAV 系統)，還有不同的作用方式 (圖一)。除了最初發現的 Cas9 造成 DNA 雙股斷裂 (DSB) 之外，後來科學家們還研究出 DNA 單股斷裂 (SSB) 和促進基因表現 (SAM) 的特殊 Cas9，GenScript 提供五種 Cas9 系統供客戶選擇 (表一)。(完整載體資訊請點選此連結)。(GenScript 亦提供 human 和 mouse 全基因的 gRNA 質體圖庫，請點選此連結)

圖一：三種 Cas9 作用方式，(a) 最初的 CRIPSR 作用方式，造成染色體 DNA double strand break (DSB)，引發 NHEJ。(b) 特殊突變 Cas9n，只能造成染色體 DNA single strand break (SSB)，需要同時有兩個位點作用才能引發 NHEJ，造成 DNA 缺失。(c) 特殊去活性 Cas9 (dCas9)，不會造成 DNA 斷裂，而是攜帶活化因子促進特定基因表現 (synergistic activation mediator, SAM)。

表一：五種 Cas9 系統比較

系統名稱	*作用方式	應用	說明
SpCas9	DSB	一般使用	最早應用於基因編輯的 CRISPR 系統，來自於 S. pyogenes 的 type II CRISPR 系統。
eSpCas9	DSB	Off-Target 較低	為 SpCas9 經過三個點突變 (K848A, K1003A, R1060A)，可以減少 non-target DNA 的結合，大幅提高專一性。
SpCas9 Nickase (Cas9nD10A)	SSB	使用上必須同時引入兩段 gRNA，Off-Target 較低	為 SpCas9 經過一個點突變 (D10A)，此突變會導致 Cas9 只能進行單股核酸裁切 (SSB)。使用上必須同時引入兩段 gRNA，辨認鄰近的區域 (需要是 DNA 雙股各一股)，造成兩個鄰近的單股 DNA 斷裂，才能夠引發 NHEJ，造成基因缺失，因此可以大幅度降低 off-target，增加專一性。
SaCas9	DSB	Cas9 蛋白質較小，AAV 包裝專用	來自於 Staphylococcus aureus，作用效率和 SpCas9 差不多，但是 SaCas9 蛋白質較小 (少1 kb DNA)，較適合 Adeno-Associated Virus (AAV) 包裝。
Transcription Activation (SAM) Plasmids	SAM	去除活性的 Cas9 (dCas9)，接上 Transactivation protein，用來專一性地促進特定基因表現	為特殊的 CRISPR 系統，其中 Cas9 透過突變而失去核酸裁切的功能 (dCas9)，同時又接上 transactivation protein (VP64)，sgRNA 也經過特別設計 (加上 two MS2 RNA aptamers)，用來專一性地促進特定基因表現。

*DSB, DNA double strand break; SSB, DNA single strand break; SAM, synergistic activation mediator.

二、服務應用
1. 針對目標基因做 knockin 或 knockout：
SpCas9, eSpCas9, SpCas9 nickase, SaCas9 皆能夠造成 DNA 雙股或單股斷裂，其中 SaCas9 適用 AAV 系統，而 SpCas9 nickase 只能造成 DNA 單股斷裂，比較資訊請參考表一。

2. 針對目標基因促進基因表現：
SAM 系統不會造成 DNA 損傷，失去活性的 Cas9 蛋白質會帶著 transactivation protein，因此反而會促進基因表現，比較資訊請參考表一。

三、服務優點
1. 免費 gRNA 資料庫：
GenScript 和張鋒實驗室共同合作 (Feng Zhang’s laboratory at the Broad Institute of MIT and Harvard)，免費提供 gRNA 資料庫，資料庫中的 gRNA 序列皆已經過驗證，能夠有效地針對目標基因，讓您放心做選擇。(免費 gRNA 資料庫請點選此連結)

2. 提供 gRNA 庫存質體，最快一週到貨：
原廠提供超過 20,000 條 gRNA 庫存質體 (預設載體為 pLentiCRISPR v2)，下訂後可於一週到貨。

3. 多種 Cas9 系統選擇：
五種 Cas9 系統選擇，SpCas9, eSpCas9, SpCas9 nickase, SaCas9, SAM，對應三種作用方式 (表一)。

4. 多種載體型式可選擇：
多種載體型式可選擇 [轉染用、慢病毒系統 [all-in-one 或 dual vector (gRNA 和 Cas9 分開]、AAV 系統] (完整載體資訊請點選此連結)。

四、服務方案

1. 客戶提供：
(1) 基因名稱 (Gene symbol/ID) or gRNA 序列
(2) 指定載體

2. 出貨規格：
(1) 4 ug 凍乾質體
(2) 定序結果

Plasmid (質體建構)-CRISPR Services (基因編輯服務)-盟基生物科技股份有限公司

CRISPR Services (基因編輯服務)

Plasmid (質體建構)

Plasmid (質體建構)

將設計好的 gRNA 接入特定載體，提供最方便的 gRNA 庫存質體，也能由客戶自行提供 gRNA 序列，並選擇適合的載體，由 GenScript 完成質體建構。