進行 CRISPR 實驗時，可由轉染或病毒方式 (Plasmid/Lentivirus) 送入 DNA (點選我可連結至 CRISPR plasmid)，讓細胞自己表現 Cas9 蛋白和 gRNA。另外一種方式是 Ribonucleoprotein (RNP) system (圖一)，直接送入 Cas9 蛋白和 gRNA 進入細胞，因此為 DNA-free 系統，可避免外源 DNA 嵌入細胞染色體，降低突變機率。GenScript 提供高純度的 sgRNA，比他牌純度更高、效果更好。
一、服務介紹
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| 圖一：RNP 示意圖，直接將 Cas9 蛋白質和 gRNA 送入細胞中，可以更快速地引發基因編輯，且能降低突變機率。 |
表一：Plasmid/Lentivirus 和 RNP system 對於 CRISPR 實驗的影響
| CRIPSR 送入方式 | Plasmid/Lentivirus | RNP system |
| 種類 | DNA | Protein & RNA |
| 作用速度 | 慢 | 快 |
| 作用時間 | 長 | 短 |
| Off-target 機率 | 高 | 低 |
| DNA 突變機率 | 高 | 低 |
細菌原生 CRISPR 系統的 gRNA (guide RNA) 分成兩部分，CRISPR RNA (crRNA) 和trans-activating crRNA (tracrRNA)，兩段 RNA 會有一部分序列進行雜合，形成 RNA 複合物 (圖二)。而實際上操作 CRISPR 實驗時，兩段 RNA 也必須先進行雜合，因此會增加處理時間。且送入細胞後，兩段 RNA 有可能分開來，導致基因編輯效率下降。因此，後來有人將兩段 RNA 合體，形成 single guide RNA (sgRNA)，如此可縮短處理時間，也能提升基因編輯效率 (表二)。Genscript 即提供高品質的 sgRNA 合成服務，同時也提供 Cas9 蛋白質 (資訊請點我)。
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| 圖二：CRISPR 系統的 gRNA (guide RNA) 有兩種方式，左圖為細菌原生系統，同時需要 CRISPR RNA (crRNA) 和trans-activating crRNA (tracrRNA) 進行雜合，才能夠有效地作用。右圖則將兩段 RNA 合在一起，形成單條 gRNA，被稱為 single guide RNA (sgRNA)。sgRNA 操作更簡單，基因編輯效率更高。 |
表二：crRNA/tracrRNA 和 gRNA 比較
| CRISPR gRNA 種類 | crRNA/tracrRNA | sgRNA |
| 原理 | 20 nt crRNA 和目標基因互補; 67 nt tracrRNA 連結 crRNA 和 Cas9 | 單一 RNA，為 crRNA 和 tracrRNA 的合體 (97-103 nt) |
| 介紹 | 細菌原生系統，為傳統方法 | 創新技術 |
| 方便性 | 低 | 高 |
| 穩定性 | 低 | 高 |
| 基因編輯效率 | 低 | 高 |
二、服務應用
以 RNP 系統進行 CRISPR 實驗，可降低 off-target 機率和突變機率，並且也能快速地作用於細胞，縮短實驗時間 (表一)。
三、服務優點
1. 和自行製備 (IVT) 相比，化學合成 sgRNA 基因編輯效率更高：
RNP 系統中需要的 gRNA 可由實驗室以體外轉錄系統自行製備 [in vitro transcription (IVT)]，或是由化學方式直接合成。資料顯示，化學合成 sgRNA 基因編輯效率更高 (圖三)，且自行製備 (IVT) 還需要花費大量的時間 (3-4小時) (表三)。
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| 圖三：以 HEK293 細胞、三個基因和兩種轉染方式做測試，證明 Genscript 化學合成 sgRNA (EasyEdit) 基因編輯效率高於自行製備 (IVT)。三個基因分別為1-RNASEH2B、2-PBRM1、3-RAB11A。 |
2. 和自行製備 (IVT) 相比，化學合成 sgRNA 的細胞存活率較高：
自行製備 (IVT) 除了基因編輯效率較低之外 (圖三)，且有多項化學殘留，以及有 5’-triphosphate，這些都會產生細胞毒性。資料顯示，自行製備 (IVT) 的 RNA 較容易導致細胞死亡，導致細胞存活率降低；相反地，化學合成 sgRNA 則不會傷害細胞 (圖四、表三)。
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| 圖四：比較自行製備 (IVT) 和化學合成 sgRNA (SafeEdit sgRNA) 對細胞存活率的影響，以 HEK293T 細胞和三個基因做比較，可以看出自行製備 (IVT) RNA 對細胞有明顯的毒性，導致存活率大幅度下降，化學合成 sgRNA 則完全不傷害細胞。 |
表三：化學合成 RNA 和自行製備 [in vitro transcription (IVT)] 比較
| RNA 產生方式 | IVT | 化學合成 |
| 方便性 | 低 | 高 |
| RNA 穩定性 | 低 | 高 |
| 細胞毒性 | 高 | 低 |
| 基因編輯效率 | 低 | 高 |
3. 無 RNase 汙染
4. 和他牌相比，Genscript sgRNA 質量更均勻
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| 圖五：以 MS 分析比較 sgRNA 質量均勻度，Genscript sgRNA 質量更均勻，Competitor S 則有多個雜峰，品質較差。 |
5. 和他牌相比，Genscript sgRNA 純度更高
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| 圖六：以 HPLC 分析 sgRNA 的純度，Genscript sgRNA 純度更高，其中 SafeEdit sgRNA 純度更是高達100% (方案請見表六)。 |
表四：以 HPLC 分析，和他牌相比，Genscript sgRNA 純度更高
| 基因/純度 | IVT | SafeEdit | EasyEdit | Competitor S | Competitor I |
| RNASEH2B | 91.50% | 100% | 42.70% | 42.50% | 35.10% |
| PBRM1 | 87.50% | -- | 46.90% | 49.00% | 37.90% |
| RAB11A | 75.50% | -- | 48.60% | 44.40% | 42.80% |
| HPRT | 98.70% | -- | 53.70% | 45.80% | 34.80% |
| 平均 | 88.30% | 100% | 48.00% | 45.40% | 37.70% |
6. 和他牌相比，Genscript sgRNA 基因編輯效率更高
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| 圖七：不同廠牌的 sgRNA 以 Lipo2000轉染 HEK293细胞，並使用相同的 sgRNA 和 Cas9 用量及比例，對細胞進行基因編輯，計算基因編輯效率。和他牌相比，Genscript sgRNA (EasyEdit) 基因編輯效率最高。 |
表五：和他牌相比，Genscript sgRNA 質量更均勻，純度和基因編輯效率更高
| Genscript | Competitor I | Competitor S | |
| MS 分析質量均一性 | 均一性高 | 均一性高 | 有多個雜峰 |
| HPLC 分析純度 | 中 (SafeEdit 純度最高) | 低 | 中 |
| 編輯效率 | 高 | 低 | 中 |
四、服務方案
1. 客戶提供：
(1) 兩種方案選擇 EasyEdit or SafeEdit (表六)
(2) gRNA 序列
(3) 需要的產量
2. 出貨規格：
(1) 凍乾 sgRNA
(2) MS 分析報告
(3) HPLC 報告 (僅 SafeEdit 方案提供)
表六：gRNA 兩種方案比較說明
(1) 兩種方案選擇 EasyEdit or SafeEdit (表六)
(2) gRNA 序列
(3) 需要的產量
2. 出貨規格：
(1) 凍乾 sgRNA
(2) MS 分析報告
(3) HPLC 報告 (僅 SafeEdit 方案提供)
表六：gRNA 兩種方案比較說明
| gRNA 方案 | EasyEdit sgRNA | SafeEdit sgRNA |
| 應用 | 一般使用 | 高純度款 (保證 90% purity)，更適合細胞實驗 |
| 純度 | 約40~50% | >90% |
| 純化方式 | Desalt | HPLC |
| QC | MS data, OD value | MS data, OD value, HPLC data |
| 和 IVT 相比 | 直接使用省時間，且毒性較低 | |
| 修飾 | 5'前三個 & 3'後三個鹼基加上 2'-O-methyl and phosphorothioate 修飾，可大幅提高 RNA 的穩定性 | |
| 加購服務 | (1) Mycoplasma testing (by qPCR) (2) Endotoxin testing (LAL) (3) Stability testing (4) Cytotoxicity testing (co-culture with cells) |
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