sgRNA synthesis (sgRNA合成)-CRISPR Services (基因編輯服務)-盟基生物科技股份有限公司

客製化抗體-盟基生物科技股份有限公司

sgRNA synthesis (sgRNA合成)

sgRNA synthesis (sgRNA合成)

CRISPR Services (基因編輯服務)

sgRNA synthesis (sgRNA合成)

用於 RNP 系統,不含外源 DNA,大幅度地降低突變機率。

CRISPR 被稱為第三代基因編輯技術,相較於先前的 TALEN 與 ZFN 系統而言,CRISPR 操作更簡單,且成功率更高。Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein (Cas) 為細菌特殊的免疫系統,保護細菌免受病毒感染。CRISPR 技術是由 Cas9 蛋白質透過 gRNA 和目標基因的鹼基配對互補性,專一性結合目標基因染色體 DNA,並進行雙股裁切 (double strand break, DSB)。而發生 DSB 的染色體會以兩種方式修復,NHEJ (non-homologous end joining) 容易造成基因功能缺失 (knockout),而 HDR (homology-directed repair) 引入 ssDNA template 則可以插入或置換特定序列 (knockin)。鹼基配對的特性使得 CRISPR 專一性更高,操作和設計更簡單,因此被廣泛應用於基因工程領域。
進行 CRISPR 實驗時,可由轉染或病毒方式 (Plasmid/Lentivirus) 送入 DNA (點選我可連結至 CRISPR plasmid),讓細胞自己表現 Cas9 蛋白和 gRNA。另外一種方式是 Ribonucleoprotein (RNP) system (圖一),直接送入 Cas9 蛋白和 gRNA 進入細胞,因此為 DNA-free 系統,可避免外源 DNA 嵌入細胞染色體,降低突變機率。GenScript 提供高純度的 sgRNA,比他牌純度更高、效果更好。


一、服務介紹
Ribonucleoprotein (RNP) system 中需要 Cas9 蛋白質和 gRNA,使用 RNP 最大的好處在於沒有外源的 DNA,因此可大幅度地降低突變機率。除此之外,相較於 plasmid DNA,蛋白質和 RNA 可直接產生作用,不需花費時間轉錄和轉譯,因此進入細胞後可較快速地引發基因編輯。並且由於是蛋白質和 RNA,因此比較快被細胞清除,off-target 機率也會大幅度地降低 (表一)。

圖一:RNP 示意圖,直接將 Cas9 蛋白質和 gRNA 送入細胞中,可以更快速地引發基因編輯,且能降低突變機率。

表一:Plasmid/Lentivirus 和 RNP system 對於 CRISPR 實驗的影響
CRIPSR 送入方式 Plasmid/Lentivirus RNP system
種類 DNA Protein & RNA
作用速度
作用時間
Off-target 機率
DNA 突變機率

細菌原生 CRISPR 系統的 gRNA (guide RNA) 分成兩部分,CRISPR RNA (crRNA) 和trans-activating crRNA (tracrRNA),兩段 RNA 會有一部分序列進行雜合,形成 RNA 複合物 (圖二)。而實際上操作 CRISPR 實驗時,兩段 RNA 也必須先進行雜合,因此會增加處理時間。且送入細胞後,兩段 RNA 有可能分開來,導致基因編輯效率下降。因此,後來有人將兩段 RNA 合體,形成 single guide RNA (sgRNA),如此可縮短處理時間,也能提升基因編輯效率 (表二)。Genscript 即提供高品質的 sgRNA 合成服務,同時也提供 Cas9 蛋白質 (資訊請點我)

圖二:CRISPR 系統的 gRNA (guide RNA) 有兩種方式,左圖為細菌原生系統,同時需要 CRISPR RNA (crRNA) 和trans-activating crRNA (tracrRNA) 進行雜合,才能夠有效地作用。右圖則將兩段 RNA 合在一起,形成單條 gRNA,被稱為 single guide RNA (sgRNA)。sgRNA 操作更簡單,基因編輯效率更高。

表二:crRNA/tracrRNA 和 gRNA 比較
CRISPR gRNA 種類 crRNA/tracrRNA sgRNA
原理 20 nt crRNA 和目標基因互補; 67 nt tracrRNA 連結 crRNA 和 Cas9 單一 RNA,為 crRNA 和 tracrRNA 的合體 (97-103 nt)
介紹 細菌原生系統,為傳統方法 創新技術
方便性
穩定性
基因編輯效率
 


二、服務應用
以 RNP 系統進行 CRISPR 實驗,可降低 off-target 機率和突變機率,並且也能快速地作用於細胞,縮短實驗時間 (表一)。


三、服務優點
1. 和自行製備 (IVT) 相比,化學合成 sgRNA 基因編輯效率更高:
RNP 系統中需要的 gRNA 可由實驗室以體外轉錄系統自行製備 [in vitro transcription (IVT)],或是由化學方式直接合成。資料顯示,化學合成 sgRNA 基因編輯效率更高 (圖三),且自行製備 (IVT) 還需要花費大量的時間 (3-4小時) (表三)。

圖三:以 HEK293 細胞、三個基因和兩種轉染方式做測試,證明 Genscript 化學合成 sgRNA (EasyEdit) 基因編輯效率高於自行製備 (IVT)。三個基因分別為1-RNASEH2B、2-PBRM1、3-RAB11A。

2. 和自行製備 (IVT) 相比,化學合成 sgRNA 的細胞存活率較高:
自行製備 (IVT) 除了基因編輯效率較低之外 (圖三),且有多項化學殘留,以及有 5’-triphosphate,這些都會產生細胞毒性。資料顯示,自行製備 (IVT) 的 RNA 較容易導致細胞死亡,導致細胞存活率降低;相反地,化學合成 sgRNA 則不會傷害細胞 (圖四、表三)。

圖四:比較自行製備 (IVT) 和化學合成 sgRNA (SafeEdit sgRNA) 對細胞存活率的影響,以 HEK293T 細胞和三個基因做比較,可以看出自行製備 (IVT) RNA 對細胞有明顯的毒性,導致存活率大幅度下降,化學合成 sgRNA 則完全不傷害細胞。

表三:化學合成 RNA 和自行製備 [in vitro transcription (IVT)] 比較
RNA 產生方式 IVT 化學合成
方便性
RNA 穩定性
細胞毒性
基因編輯效率
 
3. 無 RNase 汙染
4. 和他牌相比,Genscript sgRNA 質量更均勻


圖五:以 MS 分析比較 sgRNA 質量均勻度,Genscript sgRNA 質量更均勻,Competitor S 則有多個雜峰,品質較差。

5. 和他牌相比,Genscript sgRNA 純度更高

圖六:以 HPLC 分析 sgRNA 的純度,Genscript sgRNA 純度更高,其中 SafeEdit sgRNA 純度更是高達100% (方案請見表六)。

表四:以 HPLC 分析,和他牌相比,Genscript sgRNA 純度更高
基因/純度 IVT SafeEdit EasyEdit Competitor S Competitor I
RNASEH2B 91.50% 100% 42.70% 42.50% 35.10%
PBRM1 87.50% -- 46.90% 49.00% 37.90%
RAB11A 75.50% -- 48.60% 44.40% 42.80%
HPRT 98.70% -- 53.70% 45.80% 34.80%
平均 88.30% 100% 48.00% 45.40% 37.70%
 

6. 和他牌相比,Genscript sgRNA 基因編輯效率更高

圖七:不同廠牌的 sgRNA 以 Lipo2000轉染 HEK293细胞,並使用相同的 sgRNA 和 Cas9 用量及比例,對細胞進行基因編輯,計算基因編輯效率。和他牌相比,Genscript sgRNA (EasyEdit) 基因編輯效率最高。

表五:和他牌相比,Genscript sgRNA 質量更均勻,純度和基因編輯效率更高
  Genscript Competitor I Competitor S
MS 分析質量均一性 均一性高 均一性高 有多個雜峰
HPLC 分析純度 中 (SafeEdit 純度最高)
編輯效率


四、服務方案
1. 客戶提供:
(1) 兩種方案選擇 EasyEdit or SafeEdit (表六)
(2) gRNA 序列
(3) 需要的產量


2. 出貨規格:
(1) 凍乾 sgRNA
(2) MS 分析報告
(3) HPLC 報告 (僅 SafeEdit 方案提供)


表六:gRNA 兩種方案比較說明
gRNA 方案 EasyEdit sgRNA SafeEdit sgRNA
應用 一般使用 高純度款 (保證 90% purity),更適合細胞實驗
純度 約40~50% >90%
純化方式 Desalt HPLC
QC MS data, OD value MS data, OD value, HPLC data
和 IVT 相比 直接使用省時間,且毒性較低
修飾 5'前三個 & 3'後三個鹼基加上 2'-O-methyl and phosphorothioate 修飾,可大幅提高 RNA 的穩定性
加購服務 (1) Mycoplasma testing (by qPCR)
(2) Endotoxin testing (LAL)
(3) Stability testing
(4) Cytotoxicity testing (co-culture with cells)