進行 CRISPR 實驗時,可由轉染或病毒方式 (Plasmid/Lentivirus) 送入 DNA (點選我可連結至 CRISPR plasmid),讓細胞自己表現 Cas9 蛋白和 gRNA。另外一種方式是 Ribonucleoprotein (RNP) system (圖一),直接送入 Cas9 蛋白和 gRNA 進入細胞,因此為 DNA-free 系統,可避免外源 DNA 嵌入細胞染色體,降低突變機率。GenScript 提供高純度的 sgRNA,比他牌純度更高、效果更好。
一、服務介紹
表一:Plasmid/Lentivirus 和 RNP system 對於 CRISPR 實驗的影響
CRIPSR 送入方式 | Plasmid/Lentivirus | RNP system |
種類 | DNA | Protein & RNA |
作用速度 | 慢 | 快 |
作用時間 | 長 | 短 |
Off-target 機率 | 高 | 低 |
DNA 突變機率 | 高 | 低 |
細菌原生 CRISPR 系統的 gRNA (guide RNA) 分成兩部分,CRISPR RNA (crRNA) 和trans-activating crRNA (tracrRNA),兩段 RNA 會有一部分序列進行雜合,形成 RNA 複合物 (圖二)。而實際上操作 CRISPR 實驗時,兩段 RNA 也必須先進行雜合,因此會增加處理時間。且送入細胞後,兩段 RNA 有可能分開來,導致基因編輯效率下降。因此,後來有人將兩段 RNA 合體,形成 single guide RNA (sgRNA),如此可縮短處理時間,也能提升基因編輯效率 (表二)。Genscript 即提供高品質的 sgRNA 合成服務,同時也提供 Cas9 蛋白質 (資訊請點我)。
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圖二:CRISPR 系統的 gRNA (guide RNA) 有兩種方式,左圖為細菌原生系統,同時需要 CRISPR RNA (crRNA) 和trans-activating crRNA (tracrRNA) 進行雜合,才能夠有效地作用。右圖則將兩段 RNA 合在一起,形成單條 gRNA,被稱為 single guide RNA (sgRNA)。sgRNA 操作更簡單,基因編輯效率更高。 |
表二:crRNA/tracrRNA 和 gRNA 比較
CRISPR gRNA 種類 | crRNA/tracrRNA | sgRNA |
原理 | 20 nt crRNA 和目標基因互補; 67 nt tracrRNA 連結 crRNA 和 Cas9 | 單一 RNA,為 crRNA 和 tracrRNA 的合體 (97-103 nt) |
介紹 | 細菌原生系統,為傳統方法 | 創新技術 |
方便性 | 低 | 高 |
穩定性 | 低 | 高 |
基因編輯效率 | 低 | 高 |
二、服務應用
以 RNP 系統進行 CRISPR 實驗,可降低 off-target 機率和突變機率,並且也能快速地作用於細胞,縮短實驗時間 (表一)。
三、服務優點
1. 和自行製備 (IVT) 相比,化學合成 sgRNA 基因編輯效率更高:
RNP 系統中需要的 gRNA 可由實驗室以體外轉錄系統自行製備 [in vitro transcription (IVT)],或是由化學方式直接合成。資料顯示,化學合成 sgRNA 基因編輯效率更高 (圖三),且自行製備 (IVT) 還需要花費大量的時間 (3-4小時) (表三)。
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圖三:以 HEK293 細胞、三個基因和兩種轉染方式做測試,證明 Genscript 化學合成 sgRNA (EasyEdit) 基因編輯效率高於自行製備 (IVT)。三個基因分別為1-RNASEH2B、2-PBRM1、3-RAB11A。 |
2. 和自行製備 (IVT) 相比,化學合成 sgRNA 的細胞存活率較高:
自行製備 (IVT) 除了基因編輯效率較低之外 (圖三),且有多項化學殘留,以及有 5’-triphosphate,這些都會產生細胞毒性。資料顯示,自行製備 (IVT) 的 RNA 較容易導致細胞死亡,導致細胞存活率降低;相反地,化學合成 sgRNA 則不會傷害細胞 (圖四、表三)。
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圖四:比較自行製備 (IVT) 和化學合成 sgRNA (SafeEdit sgRNA) 對細胞存活率的影響,以 HEK293T 細胞和三個基因做比較,可以看出自行製備 (IVT) RNA 對細胞有明顯的毒性,導致存活率大幅度下降,化學合成 sgRNA 則完全不傷害細胞。 |
表三:化學合成 RNA 和自行製備 [in vitro transcription (IVT)] 比較
RNA 產生方式 | IVT | 化學合成 |
方便性 | 低 | 高 |
RNA 穩定性 | 低 | 高 |
細胞毒性 | 高 | 低 |
基因編輯效率 | 低 | 高 |
3. 無 RNase 汙染
4. 和他牌相比,Genscript sgRNA 質量更均勻
5. 和他牌相比,Genscript sgRNA 純度更高
表四:以 HPLC 分析,和他牌相比,Genscript sgRNA 純度更高
基因/純度 | IVT | SafeEdit | EasyEdit | Competitor S | Competitor I |
RNASEH2B | 91.50% | 100% | 42.70% | 42.50% | 35.10% |
PBRM1 | 87.50% | -- | 46.90% | 49.00% | 37.90% |
RAB11A | 75.50% | -- | 48.60% | 44.40% | 42.80% |
HPRT | 98.70% | -- | 53.70% | 45.80% | 34.80% |
平均 | 88.30% | 100% | 48.00% | 45.40% | 37.70% |
6. 和他牌相比,Genscript sgRNA 基因編輯效率更高
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圖七:不同廠牌的 sgRNA 以 Lipo2000轉染 HEK293细胞,並使用相同的 sgRNA 和 Cas9 用量及比例,對細胞進行基因編輯,計算基因編輯效率。和他牌相比,Genscript sgRNA (EasyEdit) 基因編輯效率最高。 |
表五:和他牌相比,Genscript sgRNA 質量更均勻,純度和基因編輯效率更高
Genscript | Competitor I | Competitor S | |
MS 分析質量均一性 | 均一性高 | 均一性高 | 有多個雜峰 |
HPLC 分析純度 | 中 (SafeEdit 純度最高) | 低 | 中 |
編輯效率 | 高 | 低 | 中 |
四、服務方案
(1) 兩種方案選擇 EasyEdit or SafeEdit (表六)
(2) gRNA 序列
(3) 需要的產量
2. 出貨規格:
(1) 凍乾 sgRNA
(2) MS 分析報告
(3) HPLC 報告 (僅 SafeEdit 方案提供)
表六:gRNA 兩種方案比較說明
gRNA 方案 | EasyEdit sgRNA | SafeEdit sgRNA |
應用 | 一般使用 | 高純度款 (保證 90% purity),更適合細胞實驗 |
純度 | 約40~50% | >90% |
純化方式 | Desalt | HPLC |
QC | MS data, OD value | MS data, OD value, HPLC data |
和 IVT 相比 | 直接使用省時間,且毒性較低 | |
修飾 | 5'前三個 & 3'後三個鹼基加上 2'-O-methyl and phosphorothioate 修飾,可大幅提高 RNA 的穩定性 | |
加購服務 | (1) Mycoplasma testing (by qPCR) (2) Endotoxin testing (LAL) (3) Stability testing (4) Cytotoxicity testing (co-culture with cells) |