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RNAi
服務介紹
服務特色
2.多種抑制方式可供選擇：siRNA, miRNA, shRNA。
◎ siRNA 有套餐組合，保證抑制效果70%以上。
◎ miRNA 有 mimic 和 inhibitor 可供選擇，並且克隆在載體上，在細胞中穩定表現。
3.多種不同修飾：方便追蹤和偵測。
服務選項
1.siRNA
(1) 單條合成
A、普通 siRNA：
GenePharma 普通的siRNA oligo 皆由 HPLC 純化，100% 除去尚未配對的單股 RNA，價格便宜，品質卓越。
B、化學修飾 siRNA：
RNAi 技術的最大難題在於化學合成 siRNA 的穩定性問題。GenePharma 所提供的化學修飾 stableTM siRNA，可延長細胞中的作用時間長達一倍左右。此外，化學修飾 siRNA 可有效減少副作用。GenePharma 化學修飾 stableTM siRNA 不僅增強於血清和細胞培養中之壽命，並加強離體條件下的應用能力 (表一、表二)。
表一 比較普通siRNA與化學修飾siRNA
表二：stableTM siRNA 化學修飾
*皆使用 HPLC 純化，纯度 95% 以上。
C、螢光修飾siRNA：
GenePharma 可以多種不同螢光標記對 siRNA 末端進行標記，螢光標記後的 siRNA 可利用流式細胞儀、螢光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等方式觀察，以確定轉染效率和優化轉染條件。螢光標記的 siRNA 還可應用於細胞內定位及雙標記分析實驗 (配合標記抗體)，以追蹤轉染過程中導入了 siRNA 的細胞，將轉染與目標蛋白表達之下游應用結合起來。
D、RNAi 對照組：
GenePharma 提供三種 RNAi 對照控制組
(1) 陰性對照組：通用陰性對照組 (negative control) 和將選中的 siRNA 序列打亂的陰性對照組 (scrambled control)。
siRNA 實驗必須要有陰性對照組，通用陰性對照組為與目的基因序列無同源性的普通陰性對照 (來自線蟲，適用於多數物種)，而 scrambled control 為和目標 siRNA 序列有相同的組成 (每個人不同)，但是和 mRNA 沒有明顯的同源性。
(2) 螢光標記的 (FAM) 的陰性對照組
與目標基因序列無同源性，可用於優化轉染條件和評估轉染效率。
(3) 陽性對照組 (positive control)
陽性對照組於一個實驗系統很重要，當可觀察到 siRNA 陽性對照的預期實驗結果時，可確保於該實驗方法中，您的轉染試驗、RNA 提取物和檢測方法皆為有效 (表三)。
表三 陽性對照siRNA
(2) 套餐組合
您只需提供基因序列 GeneID 或者 Accession number，我們免費幫您設計選擇合適的序列。我們針對目標基因提供三條 siRNA，至少一條保證可達70% 以上之抑制率，既可單獨使用又可隨意組合，以「siRNA Pool」形式提高抑制效率，並提供三種對照組 (表四)。
表四：siRNA套餐組合內容物
2. miRNA
(1) miRNA mimic & inhibitor：
miRNA mimics 為根據成熟的 microRNA 序列設計的雙股短片段 RNA，用於模擬內源性的成熟 miRNA。特異的 miRNA mimics 能夠被導入到細胞中，模擬 microRNA 的作用，或者與構建有 miRNA 結合位點的雙螢光報導系統結合，驗證 miRNA 與目標基因之間的調控關係。
micRNA inhibitor 為內源性 miRNA 的反義股單股 RNA，能夠被導入到細胞內，抑制內源性 microRNA 的作用，也可以用來抑制外源性表達 miRNA 載體的表現。miRNA inhibitor 經過甲基化修飾，使其結構更穩定。兩者皆適用於細胞。此外，原廠提供兩種之 library。
(2) Agomir & Antagomir：
GenePharma 依靠領先的核酸化學合成技術，推出 miRNA mimics 和 inhibitor 的升級產品，分別對應到 miRNA agomir和antagomir。
◎ 兩者皆經過特殊標記與化學修飾，與細胞膜親和力更高，轉染效率與穩定性皆提升很多。
◎ 干擾效果時間延長，最長可持續5-6週。
◎ 適用於 in vivo 實驗，可採用全身注射或局部注射等多種方式給藥，操作簡單方便。
【註】 agomi & antagomir 之修飾如下：
(1) agomir在反義鏈進行修飾：3'端進行膽固醇修飾；5'端兩個硫代骨架修飾 ；3'端四個硫代骨架修飾；全鏈甲基化修飾。
(2) antogimir：3'端進行膽固醇修飾；5'端兩個硫代骨架修飾；3'端四個硫代骨架修飾；全鏈甲基化修飾。
(3) control miRNA：
一個完整的實驗設計，皆必須包含對照組，其目的在於監測實驗中的實驗條件與操作是否正確，並可以此對實驗進行優化。miRNA 陰性對照組 (mimic 和 inhibitor negative control) 基於線蟲設計，可使用於人類、小鼠和大鼠。
(4) miRNA expression vector
A、microRNA 過度表現載體：
利用 CMV 啟動子表現 miRNA，可在哺乳動物細胞中快速、高效、持續地表達 pre-miRNA，經過 Drosha作用形成 small hairpin pre-miRNAs (約70 nt)，再過 Dicer 作用形成成熟的 microRNA (約22 nt)，作用到 mRNA，調控其表現。GenePharma 提供兩種過度表現 miRNA 之載體建構方式：
(1) 從天然的基因組序列中克隆建立 pre-microRNA：
序列不僅包含 pre-miRNA 莖環結構，同時包含基因組中 miRNA 上下游兩端100-200 bp 的側翼序列 (flanking sequences)。使用pol-Ⅱ (如 CMV) 啟動子，這種建構方式能夠大量表達 pre-microRNA。此外，這種建構方式所表達出來的 pre-miRNA 非常接近天然狀態。使用這種建構方式，您只需提供 miRNA 的具體資訊與指定過表達載體類型，GenePharma 即會完成序列合成和質體構建。
(2)利用 GenePharma 優化過的載體，模擬內源 miRNA-155 的表達模組 (pGCMV/EGFP/miR/Blasticidin)：
這種構建方法解決了不同 miRNA 表達效率差異的問題，同時也有效地避免了部分內源性 miRNA表達時會產生3p 與5p 的問題。miRNA 的髮夾序列融合在 EGFP 報導基因的後面，模擬 miRNA在體內的成熟過程。使用這種建構方式，您只需提供 miRNA 的具體資訊，GenePharma 即會完成序列合成和質體構建。
◎ CMV promoter 可高度表現目標基因
◎ EmGFP 利用螢光顯微鏡可觀察轉染效率
◎ Blasticidin resistance gee 可用來篩選穩定細胞株
◎ Spectinomycin 可篩選含有轉形質體的 E.coli
◎ pUC origin 的質體可於 E. coli中大量複製
B、microRNA 抑制子表達載體：
GenePharma 提供兩種 miRNA 抑制子之載體建構方式
(1) 利用 GenePharma 優化過的載體，模擬內源 miRNA-155 的表達模組：
和 miRNA 過度表現方式二使用同樣的載體系統，方便客戶使用同一套系統完成 miRNA 的過表達與抑制。您只需提供 miRNA 的具體資訊，GenePharma 即會完成序列合成和質體構建。
(2) miRNA sponge 載體構建：
GenePharma 通過建構載體，一次表達包含多個成熟 miRNA 結合位點的 RNA 序列，通過吸附結合成熟 miRNA，從而抑制 miRNA 的作用。使用這種構建方式，您需提供 miRNA 的具體資訊、預構建 miRNA inhibitor 的重複數及預構建 inhibitor 的序列資訊，GenePharma 即會完成序列合成和質體構建。
◎ 由於 miRNA sponge 是由質體編碼形成，能夠通過真核表達載體或包裝慢病毒顆粒，穩定地◎ 抑制細胞中的 microRNA。
◎ 能夠一次抑制整個家族的 microRNA，以研究整個家族的功能。
◎ 可以自由組合串聯不同 miRNA 抑制子序列，一次抑制多種不同的 miRNA。
◎ 可以利用 miRNA sponge 實現體內外 loss of function 研究。
◎ 可以用來檢測 luciferase 目標基因報告系統分析。
3.shRNA 載體
shRNA 表達載體帶有抗生素標記，可以在細胞中持續地抑制目標基因，持續數星期甚至更久。對於一個已知有效的 siRNA 序列 (經過 siRNA 合成方法篩選獲得)，需要維持較長時間時，推薦使用 shRNA 載體系統。GenePharma 致力於提供最先進和最方便的 shRNA 相關工具，推出新一代 shRNA 表達質體，可以持續產生 shRNA，進而達到持久抑制目標基因表達之目的。
◎ 方法簡單、經濟實惠，只需合成 DNA 序列。
◎ shRNA 質體穩定，易於操作。
◎ 克隆載體具有兩種形式的克隆酶切位點 BbsI 和 BamHI：
◎ BbsI 是特殊的限制內切酶，產生非對稱末端，保證插入片段方向正確，防止載體自體連接。
◎ 多種篩選標記：Neomycin 耐受基因、Hygromycin B 耐受基因、GFP 報告基因
(1) 單個合成
表五：shRNA 載體選擇 (十種)
(2) 套餐組合
針對目標基因提供四個 shRNA，保證至少一個可達70%以上的抑制率，並提供兩個對照組。
表六：shRNA套餐組合內容物
4.慢病毒 shRNA 載體：
慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質體可提供所有的轉錄和包裝 RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為了產生病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質體同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液後，可直接用於宿主細胞的感染。目標基因進入到宿主細胞之後，經過反轉錄，整合至基因組，持續表現基因。適用於初代培養細胞以及難以轉染的各種細胞，可用於製備多種穩定抑制特定基因的細胞株。
(1) 慢病毒 shRNA 載體
GenePharma Supersilencing Vector 干擾載體、包裝載體 (Helper vector-I, II, III)
通過專業設計人員的精心篩選獲得欲篩選的 siRNA 序列。合成相應的DNA序列，然後克隆於相應的慢病毒表達載體。
(2) 慢病毒包裝和效價測定
◎ 慢病毒包裝與純化，校價至少為 1×10^8 TU/mL。
◎ 需要大量病毒液用於動物實驗，也可提供校價達 10^10 TU/mL 以上高度純化的病毒液。
◎ 現有的 GAPDH 陽性對照病毒液，每支校價至少為 1×10^8 TU/mL。
(3) 慢病毒套餐
提供整套慢病毒製作：
根據目的基因相關資訊，利用高效的設計軟體，設計多條 siRNA 序列，合成 DNA 片段，連接到載體。做轉染實驗，48小時後通過即時螢光定量和 Western 的方法分析目的基因，篩選出一條最有效的 siRNA 序列。篩選出的高效重組載體和慢病毒包裝質體共轉染 293T 細胞，進行病毒包裝和生產，收集病毒液，濃縮、純化病毒液和測定校價。
客戶提供資訊
1. 抑制的目標基因名稱和序列
2. 想要針對的方式：siRNA、miRNA 或 shRNA
3. siRNA 可加上化學修飾
4. miRNA 可選擇 mimic 或 inhibitor
5. miRNA 和 shRNA 可選擇載體
6. siRNA 和 shRNA 提供套餐服務 (一次設計多條序列，保證至少一條效率70%以上)
到貨規格
1. 凍乾 RNA
2. 合成文件 (序列、產量和電泳圖)
